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bd流式细胞仪c6 fitcpeapc哪个通道

归档日期:09-22       文本归类:暗挖式通道      文章编辑:爱尚语录

  光信号转换成电压脉冲后,再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储,该标准由“分析细胞学协会”制定。

  根据FSC标准,数据存储格式应包括三个文件:样本获取文件,数据设置文件和数据分析结果。 4参数(FSC,SSC,FITC和PE)的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时,FCS数据文件为80kB.

  数据采集存储完毕后,细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC(FL1)可使用直方图,横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量(如图5-1)。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值,而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧,越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图

  双参数可在二维散点图中同时显示,X轴显示通道1(FL1),Y轴显示通道2(FL2)。3维图通过X,Y,Z三个轴分别显示每个通道的细胞量(如图5-1)。

  通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如:血样本是混合细胞群,如果想单独分析淋巴球细胞,可根据FSC或细胞大小,在FSC,SSC的散点图中设门,其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图

  数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述,分别有几种形式的点图用于显示数据,而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图5-3所示,在淋巴细胞亚群周围设门,以单独分析或分选该亚群细胞。

  门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中,我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图,二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界,二维点图可设置象限标志。如果需要,还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界(见图5-4)。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。

  图5-4 阴性对照峰M1(NORM001)和CD3 FITC阳性峰M2(NORM002) 图5-5的统计结果表明,整个事件共记录了6000个细胞,门内淋巴细胞2891个。其中M1(阴性)细胞619个,M2(CD3阳性)细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为:M2:2272/2891=78.59%.

  二维点图以双参数显示结果,每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图,用于设定阴性对照边界,全图划分为四个象限,以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限(LL)为双阴性细胞,左上象限(UL)为Y轴阳性细胞(CD19 PE),左下象限(LR)为X轴阳性细胞(CD3 FITC),右上象限(UR)为双阳性细胞(CD19+/CD3+)。

  图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域,也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域(如图5-8所示);然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中,R4门内为CD4阳性,CD3阴性的淋巴细胞亚群,其结果为:40/2866=1.40%.

  这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷,因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界,在随后的文件中,下一个样本的细胞亚群位置会发生变化,这就需要操作者重新调整区域或边界位置。 为避免这种情况的发生,我们采用一种称为集群分析(cluster analysis)的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动,自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置(见图5-10)。

  这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量,对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群,在大多数情况下,既不是100%阴性,也不是100%阳性,所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组,那么我们认为其结果是阳性的,两者间的差异越大,说明细胞的表达越高,阳性率越高。 如图5-11所示,左图为单细胞群的散射光信号,右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2,5和20(从左至右)。

  图5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率,几何均值法和中位法还用于分子(接合子)定量分析。

  QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示,Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息,用于计算每个细胞的接合点位数。 图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰(G0/G1期,S期和G2M期)不是离散的,所以我们对曲线以下的面积进行积分,以得到每个细胞亚群的百分含量结果。

  CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上,优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的,可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。

  在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分:方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包,该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值,格式为FCS2.0或FCS3.0.

  数据包必须由方案文件打开,无法单独显示,或者可由第三方软件进行分析,如WinMDI.

  流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息,所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪,然后再开启计算机。

  1、x09先开仪器后开计算机,以确保仪器和计算机之间的正常通讯。

  当图的属性为Acquire时,此图只限于采集下用,即只当进行检测时它才能显示颗粒;

  当图的属性为Analysis时,此图只限于分析已保存的数据包,它不能用于采集数据。

  当图的属性为Acquire-Analysis时,此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。

  所以方便起见,我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。

  默认情况下,FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器,及五个参数供选择使用:FS、SS、FL1、FL2、FL3.当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项,仪器自动打开633nm激光器。

  CellQuest Pro软件主要工作界面,软件类似于Office word的工作面,可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。

  在CellQuest软件下,需在选择Plot菜单,选择Format来打开图的属性对话框,其中包括了关于该图所有选项。

  建立好直方图或散点图后,我们需要对所选的参数进行命名,如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4.

  在菜单上选择Acquire栏目,选择Parameter Description,可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数,并在此对每个采集参数进行命名,FL1为CD3FITC,FL2为CD4PE……

  R是Region的首个字母,Region一般是指一个闭合形的区域,如矩形区、自由区和圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算,如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念:

  当我们要进行逻辑运算时,可变更为G1=R1 AND R2.此时G1就成了一个算术结果了。

  Region List管理门,可以重命名或删除门。Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。

  在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下,同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框:

  实验或分析过程中所建的方案可以保存下来,通File下拉菜单可以保存这些方案文件:

  如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可;方案可以分析以往的数据包(前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性),有两种方案打开以往的数据:

  方法一:选择直方图或散点图,打开该图的属性框(Plot-》Format),见下图:

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